کار با اسپکتروفتومتر نیازمند رعایت هفت اصل کلیدی است: ۱) آمادهسازی و گرم کردن دستگاه، ۲) آمادهسازی صحیح نمونه و کووت، ۳) انتخاب دقیق طول موج حداکثر جذب، ۴) صفر کردن دستگاه با بلنک، ۵) رعایت محدوده خطی قانون بیر-لامبرت، ۶) ساخت و استفاده از منحنی کالیبراسیون استاندارد، و ۷) نگهداری و خاموشسازی اصولی. توجه به این اصول، از خطاهای رایج جلوگیری کرده و دقت و صحت نتایج در آنالیزهای کمی و کیفی را تضمین میکند.
اسپکتروفتومتر آزمایشگاهی سنگ بنای آزمایشگاههای شیمی تجزیه، بیوشیمی، و کنترل کیفیت است. این دستگاه با سنجش دقیق برهمکنش نور و ماده، اطلاعات حیاتی در مورد غلظت، خلوص، و ساختار ترکیبات ارائه میدهد.
سایت راهیان نلم ازما در خصوص کاربرد اسپکتروفتومتر این چنین می گوید:
این دستگاه در اندازه گیری کیفی و کمّی انواع ترکیبات آلی، معدنی و یونهای فلزی کاربرد دارد.
تعیین غلظت مواد، اندازه گیری فعالیت آنزیم های مختلف، کلسترول، تری گلیسیرید، قند، لیپوپروتئین ها، اوره، کراتین و ترکیبات مشابه، انواع آنالیت های با بالینی و تحقیقاتی، انواع داروها و همه یونهای فلزی، با اسپکتروفتومتری امکان پذیر است. همچنین این دستگاه قابلیت اندازه گیری نمونه های فوق العاده کوچک را داشته و لذا از آن برای تجزیه عناصر مولکول های RNA استفاده می شود. لذا، دستگاه اسپکتروفتومتر در زمینه های مختلف چون تجزیه مواد در رشته های شیمی، مواد، کشاورزی، پزشکی و… کاربرد دارد .
۲. اجزای اصلی و انواع پیشرفته اسپکتروفتومتر
- منبع نور (Light Source):
- ناحیه UV: لامپ دوتریوم یا زنون.
- ناحیه Vis: لامپ تنگستن-هالوژن.
- مونوکروماتور (Monochromator): مهمترین بخش برای تولید نور تکرنگ (با پهنای باند باریک). این بخش با استفاده از منشور یا گریتینگهای پراش، نور با طول موج دلخواه را انتخاب و بقیه طیف را فیلتر میکند.
- محفظه نمونه (Sample Compartment) و کووت: محفظهای که کووت حاوی نمونه در آن قرار میگیرد.
- آشکارساز (Detector): نور عبوری از نمونه را دریافت کرده و به سیگنال الکتریکی تبدیل میکند. کیفیت آشکارساز (مانند فتودیود یا PMT) حساسیت دستگاه را تعیین میکند.
انواع رایج (بر اساس فناوری روز)
نوع دستگاه | کاربرد اصلی | نحوه کار کلیدی |
|---|---|---|
UV-Vis استاندارد | سنجش غلظت و خلوص (DNA، پروتئین، مواد شیمیایی) | نور تکرنگ (توسط مونوکروماتور) از نمونه عبور میکند. |
نانودراپ (NanoDrop) | سنجش غلظت اسیدهای نوکلئیک و پروتئینها | با استفاده از کشش سطحی، حجم $mathbf{1-2}$ میکرولیتر نمونه بین دو فیبر نوری قرار میگیرد و مسیر نوری بسیار کوچک میشود. نیاز به کووت حذف میشود. |
آرایهای دیودی (DAD) | آنالیز سریع در HPLC | نور تمام طیف ابتدا از نمونه عبور میکند و سپس توسط یک آرایه از آشکارسازها (Diode Array) به طور همزمان سنجش میشود. |
FT-IR | تحلیل ساختار مولکولی و گروههای عاملی | اندازهگیری جذب در ناحیه مادونقرمز. |
هفت اصل اساسی کار با اسپکتروفتومتر
اصل ۱: آمادهسازی و پایداری علمی دستگاه (Warm-up)
اهمیت: عدم پایداری دمایی و نوسانات شدت منبع نور، بزرگترین منبع خطای دستگاهی است.
نحوه اجرا:
- زمان روشن بودن: دستگاه را حداقل ۲۰ تا ۳۰ دقیقه قبل از شروع اندازهگیری روشن کنید تا لامپها به پایداری حرارتی برسند.
- تنظیمات پایه: مطمئن شوید پارامترهای اصلی (ناحیه اندازهگیری، پهنای باند شکاف) مطابق با پروتکل شما تنظیم شدهاند.
اصل ۲: آمادهسازی صحیح و بهینه نمونه و کووت
اهمیت: شفافیت نمونه و تمیزی کووت مستقیماً بر میزان جذب واقعی تأثیر میگذارد.
نحوه اجرا:
- شفافیت نمونه: نمونه باید کاملاً عاری از ذرات معلق، رسوب یا کدورت باشد. در صورت لزوم، حتماً نمونه را با دور بالا سانتریفیوژ یا با فیلتر $mathbf{0.2 mu m}$ فیلتر کنید. کدورت باعث پراکندگی نور و افزایش کاذب جذب میشود.
- رسیدگی به کووت: کووت را فقط از سطوح مات نگه دارید. قبل از قرار دادن در محفظه، سطوح شفاف کووت را با دستمالهای مخصوص بدون پرز تمیز کنید تا اثر انگشت یا قطرات آب پاک شوند.
- جهت کووت: همیشه کووت را طوری قرار دهید که سطح شفاف آن در مسیر پرتو نوری قرار گیرد (بیشتر کووتها دارای علامت مرجع هستند).
اصل ۳: انتخاب دقیق طول موج حداکثر جذب left(lambda_{max}right)
اهمیت: بیشترین دقت و حساسیت در lambda_{max} ماده مورد نظر به دست میآید.
نحوه اجرا:
- طیفسنجی (Scanning): برای مواد ناشناخته، ابتدا دستگاه را تنظیم کنید تا طیف کامل جذب را در یک بازه طول موجی (مثلاً 200 text{ nm} تا 800 text{ nm}) رسم کند.
- تعیین پیک: بالاترین قله (پیک) در نمودار طیفی، lambda_{max} است. تمام اندازهگیریهای کمی بعدی (غلظتسنجی) باید در همین طول موج انجام شود.
- حذف تداخل: انتخاب lambda_{max} به شما اطمینان میدهد که جذب اندازهگیری شده کمترین تداخل را از سایر مواد جاذب فرعی (ناخالصیها) دارد.
اصل ۴: صفر کردن دستگاه با بلنک
اهمیت: بلنکینگ برای حذف جذب زمینهای ضروری است.
نحوه اجرا:
- محتوای بلنک: بلنک باید حاوی تمام اجزای محلول نمونه باشد، به جز مادهای که میخواهیم غلظت آن را اندازهگیری کنیم. (مثلاً حلال، بافر، معرفهای مورد استفاده).
- فرآیند: کووت بلنک را در دستگاه قرار داده و دکمه "Zero" یا "Blank" را فشار دهید. دستگاه جذب پسزمینه را صفر میکند (text{Abs}=0).
- نتیجه: جذب اندازهگیری شده در نمونه، فقط مربوط به ماده هدف خواهد بود.
اصل ۵: رعایت محدوده خطی قانون بیر-لامبرت
اهمیت: قانون بیر-لامبرت فقط در غلظتهای پایین تا متوسط (محدوده خطی) معتبر است.
نحوه اجرا:
- محدوده بهینه Abs: دقت اندازهگیری در جذبهای بسیار پایین (<mathbf{0.1}) یا بسیار بالا (>mathbf{2}) به شدت کاهش مییابد. بهترین محدوده برای خوانش دقیق، بین mathbf{A=0.1} تا mathbf{A=1} است.
- رقیقسازی: اگر جذب نمونه اصلی شما بالاتر از A=1 یاA=1.5 است، حتماً آن را با حلال بلنک رقیقسازی کنید تا جذب در محدوده خطی قرار گیرد. غلظت واقعی سپس با ضرب در فاکتور رقت محاسبه میشود.
اصل ۶: ساخت و استفاده از منحنی کالیبراسیون استاندارد
اهمیت: این مرحله، دقیقترین راه برای تبدیل جذب اندازهگیریشده به غلظت است..
نحوه اجرا:
- تهیه استانداردها: حداقل ۵ استاندارد با غلظتهای دقیقاً مشخص در محدوده خطی تهیه کنید.
- رسم نمودار: جذب استانداردها را اندازهگیری کرده و نمودار Abs (محور Y) در برابر غلظت (محور X) را رسم کنید.
- تحلیل خطی (Linear Regression): معادله خطی $text{Abs} = m cdot c + b و ضریب همبستگی left(R^2right) را به دست آورید.
- تعیین غلظت مجهول: جذب نمونه مجهول را اندازهگیری کرده و آن را در معادله خط قرار دهید تا $c$ به دست آید.
c_{text{Unknown}} = frac{text{Abs}_{text{Unknown}} – b}{m}
اصل ۷: نگهداری، نظافت و خاموشسازی اصولی دستگاه
نحوه اجرا:
- نظافت کووت: کووتها (به ویژه کوارتزی) را بلافاصله پس از کار با آب مقطر و سپس اتانول بشویید. باقی ماندن مواد میتواند منجر به تخریب سطح نوری شود.
- محیط دستگاه: محفظه نمونه را همیشه تمیز و خشک نگه دارید.
- خاموشسازی: دستگاه را طبق دستورالعمل سازنده و از طریق دکمه اصلی خاموش کنید. هرگز برق دستگاه را مستقیماً قطع نکنید، به خصوص برای لامپهای UV که نیاز به خنک شدن تدریجی دارند.
